МИКРОСКОПИЧЕСКАЯ ТЕХНИКА

МИКРОСКОПИЧЕСКАЯ ТЕХНИКА в биологии, совокупность методов и приёмов для изучения с помощью оптич. и электронного микроскопов строения, жизнедеятельности, развития, химич. состава и физич. свойств клеток, тканей и органов. М. т. включает: подготовку живых объектов к микроскопич. исследованию и его проведение, изготовление постоянных (неживых) препаратов; микро-, гисто- и цитохимич. исследования; особые методы подготовки препаратов для электронной микроскопии.

Прижизненные наблюдения в проходящем свете осуществляются на простейших, мелких яйцах, культивируемых клетках и тканях, прозрачных участках тела многоклеточных (напр., на кровеносных сосудах в плавательной перепонке лягушки). В отражённом свете под микроскопом можно изучать поверхностные структуры клетки, ткани, органа. Для цитофизиологиче-ских наблюдений пользуются прижизненным окрашиванием, дающим представление о рН клетки и её органоидов, а также о физиологич. состоянии живого объекта. Для прижизненных наблюдений требуются: нагревательный столик (рис. 1) - особый термостат, перестраиваемый на заданную темп-ру в широком температурном диапазоне; стеклянные, пластмассовые, кварцевые, металлич. или др. камеры (рис. 2) с постоянной или проточной средой требуемого состава. Наблюдаемые объекты (чаще клетки однослойных культур) могут длит, время оставаться нормальными при достаточном снабжении их питат. веществами и кислородом. Одна из задач М. т. для живых объектов - повышение контрастности изображения, для чего используется, например, фазово-контрастное устройство. Интерференционная микроскопия дополнительно даёт сведения о толщине объекта, концентрации в нём сухого вещества, содержании воды и показателе преломления. Прижизненные наблюдения проводятся также в тёмном поле (ультрамикроскопия) с использованием спец. конденсора; при этом объект освещается сбоку, а фон остаётся тёмным. Темнопольное устройство позволяет увидеть чрезвычайно мелкие (напр., коллоидные) частицы. С помощью поляризационного микроскопа можно изучать объекты (или их элементы), обладающие оптической анизотропией. Для исследования как живых, так и неживых биологических объектов применяется люминесцентная микроскопия, особенно для изучения вторичной флуоресценции, возникающей при окраске клеток и тканей слабыми концентрациями флуоро-хромов (акридиновый оранжевый, эри-трозин, родамин и др.). Различия во флуоресценции отдельных химических веществ (нуклеиновых к-т, липидов) позволяют изучать их локализацию, динамику изменений и даже количество изучаемого вещества. Соединение белка с флуо-рохромом (изоцианат флуоресцеина) и связывание этого вещества с антителами (см. Иммунофлуоресценция) даёт возможность выяснить локализацию антигенов, судьбу антител и др. вопросы иммунологии. Недавно получил распространение метод микроскопии живых и неживых объектов в ультрафиолетовых лучах с использованием специальной кварцевой оптики. Наблюдения над живыми объектами документируются микрокиносъёмкой, особенно замедленной.

Рис. 1. Нагревательный столик на микроскопе.

Рис. 2. Камера для культивирования клеток и прижизненных наблюдений за их ростом и развитием: / - камера в собранном виде; 2 - камера в разобранном виде: а - верхняя стальная пластина; б - резиновая прокладка: в ~ покровное стекло; г - средняя секция; д - нижняя стальная пластина; 3 - часть средней секции снизу: е - каналы; ж - резервуары .

Для получения постоянных препаратов объект фиксируют, т. е. убивают так, чтобы он сохранил по возможности неизменной структуру. Наиболее распространённые фиксаторы - формалин, спирт, четырёхокись осмия, а также комбинированные фиксаторы - смеси веществ. Фиксация (особенно для электронной микроскопии) осуществляется также методом лиофилизации, высушиванием мазков (напр., крови) или отпечатков. При работе с клеточными культурами используются пластинки из стекла или слюды, на к-рых клетки располагаются в один слой. В др. случаях для микроскопии пользуются срезами, получаемыми на микротоме, объект при этом обезвоживают и заливают в парафин, целлоидин, желатину или замораживают. Для электронной микроскопии материал обычно фиксируют четырёхокисью осмия, а заливку производят в акриловые мономеры, к-рые полимеризуют соответствующим катализатором, или в эпоксидные смолы.

Микро-, гисто-и цитохи-мич. исследования. Для повышения контрастности препаратов, наблюдаемых в оптич. микроскоп, применяют красители, избирательно окрашивающие разные клеточные структуры. Особенно широко используются красители в гисто-химии. Гистохимич. реакции основаны на образовании нек-рыми веществами нерастворимых и иногда окрашенных осадков, обнаруживаемых микроскопически. Ферменты обнаруживаются в клетках по активности при их воздействии на определённые субстраты, находящиеся в ткани или добавленные извне. Интенсивность гистохимич. реакций часто изучают и оценивают визуально. Более совершенны колич. методы оценки, напр, подсчёт числа клеток с определённой интенсивностью окраски, числа зёрен осадка, а также авторадиография, ци-тофотометрия.

При электронной микроскопии вирусов, микроорганизмов, ультратонких срезов более крупных объектов их контрастность усиливают напылением частиц металла. Для негативного контраста объект помещают в раствор более плотного вещества (напр., фосфор-но-вольфрамовой к-ты), заполняющего промежутки между изучаемыми частицами, к-рые выглядят светлыми на тёмном фоне. Контраст усиливают также, применяя "электронные красители" (четырёхокись осмия, уранил и др.), избирательно связывающиеся с нек-рыми участками объекта. При использовании ферритина зёрна его, содержащие молекулы железа, обнаруживаются в составе клеточных структур. См. также Микроскоп.

Лит.: М е и с е л ь М. Н., Люминесцентная микроскопия, "Вестник АН СССР", 1953, МЬ 10, с. 3 - 10; Р о м е и с Б., Микроскопическая техника, пер. с нем., М., 1954; Брумберг Е. М., О флуоресцентных микроскопах, "Журнал общей биологии", 1955, т. 16, № 3, с. 222 - 37; Современные методы и техника морфологических исследований. [Сб. ст.], под ред. Д. А. Жданова, Л., 1955; Р о с к и н Г. И., Л е в и н с о н Л. Б., Микроскопическая техника, 3 изд., М., 1957; Аппельт Г., Введение в методы микроскопического исследования, пер. с нем., М., 1959; Зубжицкий Ю. Н., Метод люминесцентной микроскопии в микробиологии, вирусологии и иммунологии, Л., 1964.

С. Я. Залкинд.